3. Article

Daudzkārtējas PCR protokols ar PCR iekšējo kontroli (Pastrik et al., 2002.). 3.1. Oligonukleotīda praimeri Augšupejošais praimers RS - 1 - F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA - 3' Apgrieztais praimers RS - 1 - R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T - 3' Augšupejošais praimers NS - 5 - F 5'- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G - 3' Apgrieztais praimers NS-6-R 5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC - 3' No organisma DNS matricas sagaidāmā amplikona izmērs = 718 bp (RS praimeru komplekts). No 18S rRNA PCR sagaidāmā iekšējās kontroles amplikona izmērs = 310 bp (NS praimeru komplekts) 3.2. PCR reakcijas maisījums: Reaģents Reaģenta daudzums Galīgā koncentrācija Sterils ultratīrs ūdens 12,625 ul 10 x PCR buferšķīdums (1) (15 mM MgCl2) 2,5 ul 1 x (1,5 mM MgCl2) BSA (V frakcija) (10%) 0,25 ul 0,1 % d-nTP maisījums (20 mM) 0,125 ul 0,1 mM Praimers RS-1-F (10 uM) 2,0 ul 0,8 uM Praimers RS-1-R (10 uM) 2,0 ul 0,8 uM Praimers NS-5-F (10 uM) (2) 0,15 ul 0,06 uM Praimers NS-6-R (10 uM) (2) 0,15 ul 0,06 uM Taq polimerāze (5 U/ul) (1) 0,2 ul 1,0 U Parauga tilpums 5,0 ul Kopējais tilpums 25,0 ul (1) Metodes validētas, izmantojot Taq polimerāzi no Perkin Elmer (AmpliTaq) un Gibco BRL; 3.3. NS-5-F un NS-6-R praimeru koncentrācija kartupeļu stolona pamatņu ekstrakcijai optimizēta, izmantojot homogenizācijasmetodi un DNS attīrīšanu ar Pastrik (2000) metodi; 3.4. Reaģentu koncentrācijas atkārtota optimizācija ir nepieciešama, ja izmanto ekstrakciju ar kratīšanas metodi vai citu DNS izolācijas metodi; 3.5. PCR reakcijas apstākļi: 3.5.1. veikt šādu programmu: 3.5.1.1. 1 ciklu: 5 minūtes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana); 3.5.1.2. 35 ciklus: 30 sekundes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana); 3.5.1.3. 30 sekundes 58 °C temperatūrā (praimeru rūdīšana); 3.5.1.4. 45 minūtes 72 °C temperatūrā (atkārtojumu paplašināšana); 3.5.1.5. 1 ciklu: 5 minūtes 72 °C temperatūrā (galīgā paplašināšana); 3.6. turēt 4 °C temperatūrā; 3.7. Amplikona restriktāzes analīze. 3.8. PCR produkti, kas pavairoti no organisma DNS, veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu ar fermentu Bsm I vai Isoschizomere (piemēram, Mva 1269 I) pēc 30 minūtes ilgas inkubācijas 65 °C temperatūrā.