6. Article

Identifikācijas testi: 6.1. identificē iespējamās organisma izo lātu tīrkultūras, izmantojot vismaz divus no minētajiem testiem, kas balstīti uz atšķirīgiem bioloģiskajiem principiem. 6.2. IF tests: 6.2.1. sagatavot suspensiju IF buferšķīdumā, kurā ir aptuveni 106 šūnu vienā ml (6.pielikums); 6.2.2. sagatavot atbilstoša imūnseruma divkārša atšķaidījuma sērijas; 6.2.3. veikt IF procedūru; 6.2.4. IF testa rezultāts ir pozitīvs, ja IF kultūras titrs ir vienāds ar pozitīvā kontrolparauga titru; 6.3. PCR tests: 6.3.1. sagatavot suspensiju molekulāras tīrības klases sterilā ūdenī, kurā ir aptuveni 106 šūnas vienā ml.; 6.3.2. 100 µl šūnu suspensijas slēgtās mēģenēs 4 min. termokamerā vai verdoša ūdens vannā karsēt 100 °C temperatūrā. Tad paraugus var glabāt - 16 līdz - 24 °C temperatūrā, līdz tie ir nepieciešami. 6.3.3. veikt atbilstošās PCR procedūras, lai pavairotu raksturīgos amplikonus (piemēram, Seal et.al. (1993.); Pastrik un Maiss, (2000.); Pastrik et al., (2002.); Boudazin et al., (1999.); Opina et al., (1997.), Weller et.al. (1999.). 6.3.4. organisma identifikācija ir pozitīva, ja PCR amplikoniem ir tādi paši restrikcijas fragmentu garuma polimorfismi un amplikoni ir vienādi pēc izmēra ar pozitīvā kontrolparauga celmu. 6.4. FISH tests: 6.4.1. ultratīrā ūdenī sagatavot suspensiju , kurā ir aptuveni 106 šūnu vienā ml. 6.4.2. veikt FISH procedūru, kurā ir vismaz divas organismu raksturīgās oligozondes (9.pielikums). 6.4.3. FISH testa rezultāts ir pozitīvs, ja uzsējuma un pozitīvā kontrolparauga reakcijas ir vienādas. 6.5. Izolēšanas procedūra: 6.5.1. no kartupeļu bumbuļa vadaudu gredzena vai no kartupeļa, tomāta vai cita vītes skarta saimniekauga stublāja vadaudu šķiedru pavedieniem noņemt izdalījušos šķidrumu vai krāsu mainījušos audus. Suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfātbuferšķīduma (6.pielikums) un atstāt uz 10 - 15 minūtēm; 6.5.2. sagatavot suspensijas decimālatšķaidījumu sēriju; 6.5.3. 50 - 100 µl suspensijas un atšķaidījuma ieliet universālajā barotnē (NA, YPGA vai SPA; vai Kelmana tetrazola barotnē vai validētā selektīvajā barotnē (piemēram, SMSA) (5.pielikums). Uzklāt vai iztriept, izmantojot piemērotu atšķaidījuma uzsējuma metodi. Ja tas ir lietderīgi, sagatavot atsevišķas plates ar 2. bioloģiskā varianta organisma šūnu suspensijas atšķaidījumu uzsējumiem kā pozitīvo kontrolparaugus; 6.5.4. inkubēt uzsējumus 2 - 6 dienas 28 °C temperatūrā: 6.5.4.1. universālā barotnē organisma virulentie izolāti veido pērļaini baltas, plakanas, neregulāras un šķidras konsistences kolonijas, kuru centrā bieži attīstās raksturīgi spirāles veida vijumi. Organisma nevirulentās formas veido nelielas, apaļas, sviestveida konsistences kolonijas krēmbaltā krāsā. 6.5.4.2. kelmana tetrazola un SMSA barotnē spirāles veida vijumi ir asinssarkanā krāsā. Organisma nevirulentās formas veido nelielas, apaļas, sviestveida konsistences kolonijas tumši sarkanā krāsā.