4. Article

DNS ekstrahēšana Kopējo DNS ekstrahē saskaņā ar ražotāja norādījumiem, izmantojot DNS audu ekstrahēšanas komplektu un EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen). Katrai paraugu partijai apstrādā ekstrahēšanas kontrolparaugu (Calf Thymus DNS) un negatīvo kontrolparaugu (G2 buferšķīdums). DNS eluē 50 μl tilpumā. Lai nodrošinātu, ka ekstrahēšana beigusies sekmīgi, ar NanoDrop aparāta palīdzību nosaka DNS koncentrāciju visos paraugos un kontrolparaugos. Ja ekstrahētā DNS nav tūlīt nepieciešama, to sasaldē −20 oC temperatūrā. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR), ar ko konstatē vēžu baltplankumu slimības vīrusu WSSV konstatēšanai izmantojamā metode ir divsoļu atgriezeniskās transkriptāzes PCR un kurā pirmajā un otrajā PCR raundā amplificē rRNS gēna 18s 1447 bp un 848 bp amplikonu. Pirmā raunda PCR reakcijai jāsagatavo 50 μl tilpums, kurā galīgajās koncentrācijās ir 1 x GoTaq Buffer (Promega), 5mM MgCl2, 1 pmol/μl WSSV praimera 146 F1, 1 pmol/μl WSSV praimera 146 R1, 0,25 mM dNTPs, 1,25 U Taq polimerāzes un 2,5 μl DNS. Reakciju ar visiem paraugiem izpilda dublikātā kopā ar negatīvu ekstrahēšanas kontrolparaugu, negatīvu PCR kontrolparaugu (DNS vietā pievienoti 2,5 μl H2O) un pozitīvu kontrolparaugu. Pozitīvais kontrolparaugs ir atšķaidīts vēžu baltplankumu slimības vīrusa plazmīds, kas saražots un validēts lietošanai attiecīgajā laboratorijā (pieejams no EURL). N.p.k.Otrā raunda WSSV PCR reakciju sagatavo tāpat kā pirmā raunda reakciju, taču izmanto WSSV 146 F2/R2 praimeru komplektu un vēl vienu pozitīvu kontrolparaugu, ar kura palīdzību pārliecinās, vai šis PCR posms ir izdevies. Praimeris Sekvence1.WSSV 146 F1ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG2.WSSV 146 R1TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA3.WSSV 146 F2GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA4.WSSV 146 R2TACGGCAGCTGCTGCACCTTGTPCR produktus izgulsnē, izmantojot paņēmienu ar nātrija acetātu, kur 10 μl NaAc, 70 μl H2O un 250 μl etilspirta pievieno 20 μl DNS, apstrādā virpuļmikserī un ar 13 000 rpm 20 minūtes centrifugē, centrifugātu izņem un stobriņu skalo ar 200 μl absolūtā spirta, piecas minūtes centrifugējot ar 13 000 rpm. Stobriņu piecas minūtes žāvē pie 37 oC. Stobriņos pievieno 25 μl Hi-Di formamīda, divas minūtes uzkarsē līdz 95 oC un labi apstrādā virpuļmikserī. Paraugus atbilstoši ražotāja norādījumiem sekvenē ar analizatora ABI3130xl Avant Genetic palīdzību. Sekvenēšanas rezultātus analizē, izmantojot sekvenēšanas programmatūru Sequencher un sekvences ar sekvencēm salāgo, izmantojot BLAST funkciju NCBI datubāzē. Iekšlietu ministrs Rihards Kozlovskis