5. Article

Imūnhistoķīmija (IHC) Formalīnā fiksētu audu parafinētiem griezumiem izmanto poliklonālas antivielas pret ISAV nukleoproteīnu. Izmeklē vidusnieri un sirdi (pārejas vieta, kurā ietilpst trīs kambari un vārsti). Patoloģisku pazīmju radītu aizdomu gadījumus pārbauda, izmantojot pozitīvu IHC. Histoloģiskos griezumus sagatavo pēc standartmetodēm. 5.1. Audu griezumu sagatavošana Audus saskaņā ar standartprotokoliem vismaz vienu dienu fiksē neitrālā 10 % formalīna fosfātu buferšķīdumā, atūdeņo ar pakāpeniski pieaugoša stipruma etilspirtu, dzidrina ar ksilēnu un iegulda parafīnā. Patomorfoloģijas un IHC vajadzībām apmēram 5 μm biezus griezumus (IHC vajadzībām - uz stikliņiem ar poli-L-lizīna apvalku) 20 minūtes karsē 56 °C līdz 58 °C (maksimāli 60 °C) temperatūrā, ar ksilēna palīdzību atvasko, ar pakāpeniski sarūkoša stipruma etilspirtu rehidratē, kā arī saskaņā ar 2. punktu krāso ar hematoksilīnu un eozīnu. 5.2. Krāsošanas procedūra IHC vajadzībām Jebkādu inkubēšanu veic istabas temperatūrā uz svārstplatformas, ja vien šajā lēmumā nav paredzēts citādi: (a) antigēnu atgūšanu nodrošina, griezumus 2 × 6 minūtes vārot 0,1 M citrāta buferšķīdumā ar pH 6,0, pēc kā 20 min veic bloķēšanu ar 5 % piena beztauku sausnas un 2 % kazas seruma 50 mM TBS šķīdumā (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6); (b) pēc tam griezumus uz nakti inkubē ar primāru antivielu (monospecifisku truša antivielu pret lašu infekciozās anēmijas vīrusa nukleoproteīnu), kura atšķaidīta 1 % piena beztauku sausnas saturošā TBS, pēc tam trīsreiz skalo ar 0,1 % Tween 20 saturošu TBS; (c) saistītu antivielu konstatēšanai griezumus 60 minūtes inkubē truša IgG antivielas sārmainās fosfatāzes konjugātā. Pēc galīgās skalošanas pievieno Fast Red (1 mg ml-l) un naftola AS-MX fosfātu (0,2 mg ml-1) ar 1 mM levamizola 0,1 M TBS (pH 8,2) un dod iespēju 20 minūtes attīstīties. Pēc tam griezumus skalo krāna ūdenī, kontrastam krāso ar Harisa hematoksilīnu un pārklāj ar pārklājbarotni uz ūdens bāzes. Katrā testa sagatavošanā iekļauj kontrolparaugus - attiecībā uz lašu infekciozās anēmijas vīrusu gan pozitīvus, gan negatīvus audu griezumus. 5.3. IHC rezultātu interpretēšana IHC testa rezultātus interpretē tā, kā aprakstīts turpmāk šī punkta a) un b) apakšpunktā: a) kontrolgriezumus par pozitīviem uzskata tad, ja kontrolgriezumiem skaidri saskatāms, ka endokarda asinsvadu endotēlija šūnu citoplazma un kodols ir iekrāsoti sarkani (sarkanīgi). Testa parauga griezumu uzskata par pozitīvu tikai tad, ja šādu skaidri saskatāmu sarkanu kodola iekrāsojumu konstatē endotēlija šūnām; b) kontrolgriezumus par negatīviem uzskata tad, ja tiem nav novērojama nekāda būtiska krāsas reakcija. Tā kā ortomiksovīrusa nukleoproteīnam vīrusa replikācijas stadijā ir raksturīga lokalizācija kodolā, taču bieži vien vienlaicīgi izteiktāk tiek iekrāsota citoplazma. Tāds citoplazmas iekrāsojums un cita veida iekrāsojums, kas nav lokalizēts kodolā, uzskatāms par nespecifisku vai neizšķirīgu. Pozitīvā gadījumā izteiktākās iekrāsojuma reakcijas parasti vērojamas sirds un nieru endotēlija šūnās. Ļoti plašos hemorāģiskos bojājumos endotēlija krāsojuma reakcijas var būt maz izteiktas vai vispār nav novērojamas, iespējams, inficētajās endotēlija šūnās notiekošas līzes dēļ.