37. Article

Saskaņā ar Guthrie et al. (2013) daži pamatsoļi, ko var mainīt atkarībā no vietējām (gadījumam specifiskām) prasībām, izmantotajiem testēšanas komplektiem un pieejamā aprīkojuma: 37.1. praimeru un zondes sekvences AHSV sugas vīrusu noteikšanai: 37.1.1. tiešais praimeris - 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′; 37.1.2. atgriezeniskais praimeris - 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′; 37.1.3. MGB-TaqMan zonde - 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′; 37.2. praimera un zondes maisījuma atšķaidījumus pagatavo 25 × koncentrācijā 5 μΜ attiecībā uz tiešo un atgriezenisko praimeri un 3 μΜ attiecībā uz zondi. Jāsagatavo testa plates izkārtojums un jāieraksta reāllaika PCR mašīnas programmatūrā. Izmantojot izkārtojumu par norādi, μl paraugu RNS, tostarp testa paraugus un pozitīvās un negatīvās kontroles, pievieno attiecīgajās plates iedobēs, kā paredzēts norādē; 37.3. RNS denaturē, karsējot 5 minūtes 95 °C temperatūrā, un pēc tam vismaz 3 minūtes ātri atdzesē uz ledus; 37.4. sagatavo attiecīgu daudzumu viensoļa reāllaika RT-PCR reaģentu maisījuma atbilstoši analizējamo paraugu skaitam pēc ražotāja norādījumiem. 1 μl no 25 × praimera un zondes maisījuma atšķaidījuma (37.2. apakšpunkts) iekļauj reaģentu maisījumā, lai katrā iedobē iegūtu galīgo koncentrāciju 200 nM attiecībā uz katru praimeri un 120 nM zondes. 20 μl reaģentu maisījuma sadala katrā iedobē uz PCR plates, kas satur denaturēto RNS; 37.5. plati ievieto reāllaikā amplifikatorā, kas ieprogrammēts atgriezeniskās transkripcijas un cDNS amplifikācijas/fluorescences noteikšanai atbilstoši ražotāja norādēm. Amplifikācijas apstākļi ietver, piemēram, pirmo atgriezeniskās transkripcijas soli 10 minūšu 48 °C temperatūrā un tad 10 minūšu 95 °C temperatūrā, un 40 ciklu pa 15 sekundēm 95 °C temperatūrā, un 45 sekundes 60 °C temperatūrā; 37.6. paraugi ir uzskatāmi par pozitīviem, ja AHSV RT-PCR analīzes normalizēta fluorescence pārsniedz 0,1 slieksni 36 PCR ciklos visos parauga atkārtojumos.